【研究进展】伊曲康唑和25-羟基胆固醇显著降低了非洲猪瘟病毒复制

2019年2月26日，西班牙国家农业和食品研究与技术研究所生物技术部Inmaculada Galindo等学者在viruses上发表了题为Lipid Exchange Factors at Membrane Contact Sites in African Swine Fever Virus Infection的文章。

非洲猪瘟病毒（ASFV）引起一种传染性疾病，感染野猪和家猪。非洲猪瘟（ASF）导致养猪业严重的经济损失，这是由于该病的死亡率高，并且在缺乏有效疫苗的情况下难以控制该病。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科家族的唯一成员。它是一种二十面体形态的包膜病毒，平均直径200纳米。基因组结构由一个末端反向重复的线性双链DNA和发夹环组成。非洲猪瘟病毒基因组的长度为170-190kbp，编码范围为151-167个开放阅读框(ORFs)。其复制周期主要在细胞质。然而，它需要在细胞核进行早期病毒DNA合成。

非洲猪瘟病毒感染周期开始于病毒的吸附，通过结合一种未知的特异性受体（介导内吞作用）进入宿主细胞。

一旦病毒DNA被释放到细胞质中，它就会聚集到靠近微管组织中心（MTOC）的核周区域。新病毒的复制和装配发生在复制站点或“病毒工厂”。新的子代病毒离开工厂，被运送到细胞表面，在那里它们通过芽孢释放。与其他病毒相似，为了扩增其基因组，非洲猪瘟病毒重组细胞内膜，在细胞质中生成复制细胞器（ROS）或病毒工厂（VFS）。尽管它们与病毒复制相关，但病毒工厂形成的机制和相关分子仍然未知。最近的科学证据表明，脂类是几种病毒感染中形成病毒工厂的基础。

伊曲康唑（ITZ）是一种以甾醇转运分子如羟甾醇结合蛋白（OSBP）和OSBP相关蛋白4（orp4）为靶点的抗真菌药物。

25-羟基胆固醇（25-HC）通过高亲和力结合羟甾醇结合蛋白（OSBP）来抑制脂质转运。

本研究中使用细胞适应性BA71V分离株，分析了在Vero细胞培养中伊曲康唑（ITZ）和25-羟基胆固醇（25-HC）的抗非洲猪瘟病毒作用。

结果发现伊曲康唑（ITZ）和25-羟基胆固醇（25-HC）显著降低了非洲猪瘟病毒的复制。

我们推测ITZ可能干扰OSBP在胆固醇转运到非洲猪瘟病毒复制位点的功能。用流式细胞术检测16 hpi时GFP和p72蛋白的表达，以测定该化合物对感染性的影响。

表达GFP的细胞，被融合到早期病毒p30蛋白的启动子上表达GFP的重组病毒感染，数量略有减少。然而，抑制剂显著影响晚期p72蛋白的表达。

与对照细胞相比，ITZ引起表达晚期p72蛋白的细胞数量的剂量依赖性减少，在100μm浓度下达到约65%的抑制。该结果与溶剂二甲基亚砜处理的对照组进行了比较（图3A）。

为了证实抑制非洲猪瘟病毒感染的效应或ITZ与OSBP有关，受感染的细胞用25-HC预处理，25-HC是OSBP的一种高亲和力配体，可抑制OSBP介导的胆固醇转移。我们发现了类似的结果，如图3B所示。添加25-HC显著减少了约70%的非洲猪瘟病毒感染，其效果在感染后期更加显著。

随后我们评估了其他感染参数。病毒蛋白的表达通过受感染的Vero细胞提取物的Western blotting分析，病毒DNA复制的实时荧光定量PCR分析，均在16 hpi。与用二甲基亚砜处理的细胞相比，用ITZ处理的细胞中的病毒蛋白产生量p30和p72减少（图4A）。正如预期的那样，其他感染参数均减少（图4B），病毒滴度降低约1 log（图4C）。

图3 伊曲康唑（ITZ）和25-羟基胆固醇（25-HC）抑制剂对非洲猪瘟病毒感染的影响

用(A)伊曲康唑（ITZ）或(B)25-羟基胆固醇（25-HC）预处理Vero细胞，用Ba71V或Bp30GFP感染16hpi。用流式细胞仪检测感染细胞，用溶剂二甲基亚砜或乙醇处理的细胞来进行百分比标准化。误差线表示为三个独立实验的标准差。统计显著性差异用星号表示(*** p < 0.001, ** p < 0.01; * p < 0.05)。

图4 (A) western blot实验显示伊曲康唑（ITZ）处理降低了BA71V感染后病毒蛋白表达。(B) 实时荧光定量PCR实验显示非洲猪瘟病毒基因组拷贝数减少(C)在BA71V感染Vero细胞24 hpi时，通过菌斑分析伊曲康唑（ITZ）对病毒滴度的影响。误差线显示三个独立实验的标准差。统计显著性差异用星号表示（***p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01）。

我们发现ITZ处理降低了非洲猪瘟病毒感染性和病毒复制。ITZ几乎不影响GFP阳性的感染细胞，但显著降低了晚期p72蛋白的表达。由于GFP在早期蛋白p30启动子的控制下表达，这些结果表明，ITZ不影响病毒进入或早期基因表达。我们的研究结果表明，与其他病毒性疾病类似，这种效应可能是由于向病毒复制部位供应的脂质减少所致。

最近的一项研究表明，ITZ通过靶向氧甾醇结合蛋白（OSBP）和OSBP相关蛋白4（ORP4）来抑制肠道病毒和丙型肝炎（HCV）的复制。ITZ与OSBP的直接结合，定位于病毒复制细胞器，破坏其脂质转运功能，这就可以解释ITZ的抗病毒作用。

为了验证OSBP是非洲猪瘟病毒感染的相关靶点，用25-HC预处理感染细胞。25-HC与OSBP结合，具有很高的亲和力，可作为OSBP胆固醇转移的抑制剂。我们发现25-HC也能显著抑制非洲猪瘟病毒感染。

这些结果以及胆固醇对非洲猪瘟病毒产生感染性至关重要的事实表明，在这种特定情况下，ITZ和25-HC的抗病毒活性可能是由于阻断了胆固醇通向病毒工厂的通路，这意味着非洲猪瘟病毒严格依赖于这些脂质供应进行复制。一直以来，我们发现使用ITZ可以减少病毒工厂周围的胆固醇积累。然而，ITZ不影响与脂质转运相关的其他蛋白在膜接触位点的表达或定位，如ACBD3、PI4K。

本研究显示，ITZ和25-HC降低了非洲猪瘟病毒的复制，但没有完全阻止病毒周期的进展。

本文由胡鹏飞、周盼伊编译整理，本栏目由周盼伊统筹策划