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非瘟疫苗,离我们到底还有多远?

日期: 2019-03-11
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自2018年8月开始,非洲猪瘟疫情肆虐中华大地,养猪户翘首期盼唯一的救命稻草——非洲猪瘟疫苗能早日横空出世,网络上关于疫苗研制成功的传闻和消息很多,但大多是谣传而不了了之。本文从盘点最近两年关于非瘟疫苗的传闻和报道,为什么一个百年老病至今都没有疫苗?非瘟疫苗研发的坎坷之路和理性看待非瘟疫情四个方面探讨非瘟疫苗离我们到底还有多远?我们应该怎么做?



一、最近两年关于非洲猪瘟疫苗的传闻和报道


2017年2月22日,国家知识产权局公布英国皮尔布莱特研究所“减毒的非洲猪瘟病毒疫苗”的发明专利申请。


2017年底,欧盟发起了针对非洲猪瘟疫苗的创新行动,制作了疫苗开发的潜在策略和可能的研究步骤等蓝图及路线图,该行动开始日期是2018年10月16日,2019年1月23日截止。


2018年3月,西班牙研究人员通过使用反向遗传的方法,以野毒株NH/P68为骨架,构建了A238L蛋白缺失株,A224L蛋白缺失株,EP153R蛋白缺失株和A276R蛋白缺失株。攻毒试验表明构建的减毒株仅对同源毒株有保护,但可能引起安全性问题,导致慢性非瘟感染。


2018年9月13—16日,在武汉召开的第七届中国兽药大会上,农业农村部畜牧兽医局副局长陈光华表示:“杜绝非法制造和销售所谓能够预防、治疗非洲猪瘟的疫苗、诊断试剂和兽药等行为”;而9月26日的国务院常务会议指出,要开展(非洲猪瘟)综合防治、疫苗研发等关键技术攻关。


两则消息看似观点相反,实则所占的高度不一样,前者是站在监管的层面,防止有人浑水摸鱼发国难财,后者是站在国家层面要求科研单位刻苦攻关,两者并不矛盾。


2018年10月15日,美国农业部农业研究局在联邦公报中公示,授予硕腾独家使用2016年12月17日发布的专利号为9528094的“基于MGF基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗”专利。


二、为什么一个传播了近百年的老病至今没有疫苗?


非瘟病毒粒子结构类似于虹彩病毒科,基因结构和复制方式类似于痘病毒科。


非洲猪瘟因很少产生中和抗体,所以,无血清型概念,但可以通过红细胞吸附试验,分成8个血清群,不同的血清群之间交叉保护力比较差,百年老病没有疫苗与此相关。


1免疫组织损伤:


非洲猪瘟病毒主要感染猪的单核吞噬细胞和淋巴细胞,引起细胞坏死,进而导致机体免疫功能低下或不全,产生不完全中和抗体,与艾滋病病毒相类似。


脾脏的红髓、边缘区、周围动脉淋巴鞘和巨噬细胞鞘以及淋巴结的副皮质区、滤泡间区和毛细血管后静脉坏死破坏,这些部位都含有抗原传递细胞,其破坏程度取决于病毒的毒力,毒力愈强,造成的破坏愈严重。


研究表明:超强毒感染猪幸存10天后血清中仍测不出病毒特异抗体,而中等毒力毒株感染猪在感染后的3~4 天可测出特异IgM(仅提示近期感染,利于早期诊断), 6~7天可测出特异IgG(主要的抗感染抗体)。


2抗原蛋白太多且易突变


我国发现的非洲猪瘟有180kb的基因组,含有约150个开放阅读框,可编码150~200种蛋白质。目前确认的有24种基因型,其中,北非为Ⅰ型,东欧、高加索、俄罗斯、中国为Ⅱ型。本次中国非洲猪瘟疫情的毒株基因序列与格鲁吉亚2007株和俄罗斯伊尔库茨克2017株的相应序列完全一致。


(1)不清楚哪些蛋白与免疫保护相关


非洲猪瘟病毒编码的150多个蛋白质中,大致明确结构蛋白有50余个,其中,参与病毒复制的蛋白大约为30个,其他蛋白质的作用尚不明了。


有人认为非洲猪瘟难以做出能产生有效中和抗体的疫苗,与该病毒基因组的高度变异性有关,其中,包括不同病毒分离株基因组长度的多样性,病毒克隆异质性以及病毒传代过程中的易变性。


到目前为止,除针对相对分子量为7.2×104的主要结构蛋白的单抗和针对相对分子量为2.7×104的抗血清,具有一定程度的非典型中和作用外,尚未发现其他更为理想的保护性抗原。


(2)抗原竞争:


维努埃拉认为处于强势的非中和性抗原抑制处于弱势的中和性抗原,这种竞争抑制可以发生在不同抗原分子之间,也可以发生在同一抗原的不同抗原决定簇之间


欲从如此众多的蛋白抗原中找出具有竞争抑制或中和作用的抗原实属不易。


3免疫逃避


非洲猪瘟病毒直径175~215nm,基因组170~190kb(千碱基),是蓝耳病毒(15kb)的12倍,猪瘟病毒(12kb)的15倍,口蹄疫病毒(8kb)的24倍。


病毒的基因组很大,抗免疫因子多、免疫逃逸路径很多。


与痘苗病毒类似,痘苗病毒可编码可溶性白细胞介素 -1、γ-干扰素和肿瘤坏死因子“受体” ,这些可溶性受体:只含有位于细胞外的细胞因子结合部位 ,而缺少真正细胞因子受体的膜结合部位和与信号传递有关的细胞内尾部。 因此 ,这些“受体”类似物能从病毒感染细胞释放到血流中去,在全身各处与细胞因子结合 ,以阻断相应细胞因子与其真正受体的结合,躲避宿主免疫监视。


通俗的讲免疫逃避就好像警察抓小偷时,抓住了一个假小偷,而真小偷还在异地作案。


目前,已经发现非洲猪瘟病毒编码类似于 T淋巴细胞吸附受体CD2的蛋白质,由此 CD2类似物引起的 ASFV血吸附现象只不过是一种表象,而病毒编码该蛋白的真正目的是阻碍T细胞的吸附和激活,以此削弱宿主免疫应答中的细胞相互作用,降低免疫应答的等级。


4免疫抑制


研究证实,只有活病毒才具有抑制效应,病毒复制旺盛期抑制效应最明显;所以,非洲猪瘟感染初期会出现反复发热,用药则吃停药则不吃,快的三五天,慢的十一二天才出现耳朵、皮肤发红发紫,拉血而死亡。


非洲猪瘟弱毒株对~有丝分裂原(淋巴细胞多克隆激活剂,多数是凝集素类蛋白质,如刀豆素、植物血凝素等能够活化T细胞;脂多糖、葡萄球菌A蛋白能够活化B细胞)刺激,引起的淋巴细胞激活具有显著的抑制作用,且与病毒的剂量和作用时间呈正相关;而强毒株具有相反的作用 ,即具有促进有丝分裂原潜能和增强免疫球蛋白分泌活性的作用。


5木马机制:


马卡洛夫等认为,该病毒的特殊靶细胞(单核吞噬细胞)表面、具有抗体(IgG)的Fc受体而有调理吞噬作用,从而给藏于病毒-抗体复合物中的病毒以可乘之机进入靶细胞。 这种“木马”机制类似于登革热等病毒感染。


通俗的讲木马机制就好似警察抓了一群正在赌博的赌徒,而被抓的这些赌徒里面混了一个恐怖分子,跟随被抓获的赌徒进入警察局以后,结果把警察局给炸了。


三、非洲猪瘟疫苗研发的坎坷历程


(一)灭活苗


1.人们在非洲猪瘟病毒发现之后不久即已开始灭活苗的研发,但经加热 、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、β-丙内酯、乙酰氮丙啶和缩水甘油醛等传统方法处理的非洲猪瘟灭活疫苗,虽能刺激猪产生抗体,但难以检测到中和抗体,无法抵御野毒攻击


原理似乎是非洲猪瘟分子颗粒比较大,把病毒简单灭活后就好像给猪肌注鸡蛋清,异源蛋白虽能继发机体产生发热等免疫反应,但最终不会产生特异性抗体


目前,研究结果已证实:用非洲猪瘟病毒接种的肺泡巨噬细胞悬浮液制备的灭活疫苗,免疫后无保护作用;用非洲猪瘟病毒感染猪的脾组织匀浆,经弗氏完全佐剂乳化制、备的灭活疫苗,仅可以使非瘟同源毒株的攻毒保护率达到70%,且所有存活猪都表现出临床症状,该试验的第二次验证仍只能达到50%以上的保护率;添加最新佐剂(如 poly-gentm或emulsigen-d等)或免疫增强剂,制成的灭活疫苗也仍然无法达到有效保护的目的。


结论:简便、易操作、不散毒的灭活苗研发,已经试过多种方法,似乎是死路一条。


(二)弱毒疫苗


1.传代弱毒苗


早在1957年,人们就认识到感染低毒力非洲猪瘟病毒存活下来的猪,可以抵御同基因型强毒株的攻击。随后,在20世纪60年代,大量的试验证实非洲猪瘟病毒经细胞多次传代培养后可以使其毒力下降,接种家猪不再产生致死性感染。


1963年曼索等证实:通过猪骨髓细胞传代致弱的非洲猪瘟弱毒疫苗可以抵御强毒株攻击。此弱毒疫苗随后在葡萄牙和西班牙进行田间试验,但却造成了灾难性的后果,免疫后的猪出现了肺炎、运动障碍、皮肤溃疡、流产和死亡等疫苗免疫副作用。特别是在葡萄牙,55万头猪免疫后有近13万头出现免疫副作用,并且出现大量病毒携带猪


由于此次失败的临床经验,非洲猪瘟再无传代弱毒疫苗进行过田间试验。


结论:非洲猪瘟传代弱毒疫苗接种后,即使不接种强毒株,大多数被免疫的猪仍会出现慢性感染,且最终死亡率达到10%~50%。


2.天然弱毒苗


人们发现,采用天然致弱毒株免疫能产生针对同源强毒株的攻毒保护,保护率在66%~100%之间


查普曼等对葡萄牙分离的基因Ⅰ型自然弱毒株OURT88/3进行了全基因测序,经与西非强毒株Benin97/1和西班牙Vero细胞传代适应 株BA71V对比分析后发现, OURT88/3和BA71V均出现了8~10kb大小片段的基因丢失,这些基因的丢失可以使非洲猪瘟病毒致弱或增强机体的免疫水平。


例如:以OURT88/3免疫并用致弱性OURT88/1毒株进行加强免疫后,可以增加I 型干扰素的产生和增强干扰素的反应强度,还可诱导机体产生针对非洲猪瘟I型不同分离毒株的交叉保护,但是也可造成很多副反应


结论:天然弱毒苗对区域性同源毒株攻击效果优异,但实际操作中,海选(天然弱毒株)难度大、确定当地基因型难度大、疫苗生产难度大。


3.减毒(重组)活疫苗:


通过基因敲除毒力基因或者免疫抑制基因的方式制备ASF弱毒疫苗。


研究发现:敲除多基因家族360和530里面,参与核苷酸代谢的胸腺嘧啶核苷酸激酶和B119L或9GL基因,可降低病毒在巨噬细胞中繁殖能力,免疫后40天攻毒,猪没有发热和毒血症;删除DP71L基因和DP96R基因,可降低病毒的毒力。但和传代弱毒苗一样,减毒活疫苗暂时也无法保证疫苗的安全性或持续感染,此外,减毒疫苗对异源毒株的保护力偏差。


结论:减毒弱毒苗是未来研究的热点,难点是非洲猪瘟病毒编码的150~200个蛋白质里面,所有毒力基因和免疫抑制基因到底有多少?是哪一个蛋白质?尚未完全探索清楚。


(三)亚单位疫苗


亚单位疫苗是将具有中和表位的非洲猪瘟病毒保护性抗原基因,在原核或真核细胞中表达,并将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞,以诱导产生高滴度的抗非洲猪瘟病毒的中和抗体。


非洲猪瘟病毒编码的结构蛋白很多,但恢复期猪血清显示P72、P30和P54为感染过程中引起体液免疫应答最重要的3个抗原蛋白;其中,P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附,P30的抗体可以阻止病毒内吞。


但是,戈麦斯普多塔等采用重组杆状病毒表达的P30和P54蛋白制备的疫苗仅能提供50%的保护;尼兰等证实将P30/P54和P72免疫后不能提供免疫保护,仅能延缓临床症状出现时间和降低病毒血症水平


结论:面对非洲猪瘟病毒众多的抗原结构蛋白和复杂的免疫刺激过程,单纯依靠一种或几种蛋白质很难达到免疫预防效果。


四、理性看待非瘟疫情及非瘟疫苗


1.非洲猪瘟真正造成重大经济损失的是恐慌性抛售:疫区大多数猪场都是一头母猪发病,有人说是非洲猪瘟感染,马上就把猪场内所有体重200斤以上的大猪抛售,不谈价格,只要给钱、落袋为安。


2.造成疫情传播最直接的因素是运输车辆,和病死猪处理不当或不及时:疫区非洲猪瘟的推进路线非常清晰,一般都是先从路边的村庄发生,因最早发病的猪场病死猪随意堆放,很快整个村庄的猪场无一幸免。还有的猪场是刚卖完猪以后三四天就全场发病。


3.做好生物安全是当前相对而言最合适的防控措施:综上所述,在没有完全弄明白非洲猪瘟编码的所有蛋白质的各自功能之前,无法做出完全放心的疫苗,所以,当前唯有做好生物安全才是正路。


4.任何疫病都有一个由强转弱的演变过程:尽管暂时没有疫苗,也没有特效药物治疗,但猪自身会抵抗,何况,国外流行近百年,同样没有疫苗没有特效药,但国外的猪种也没有灭绝。一般疫情第一波攻击都相对比较猛烈,第二波攻击就相对势微,慢慢的就会演化为一个像高热病一样的常在病。


本文由赵浩先生提供并授权养猪信息网发布,特此致谢!文中观点仅供参考,不代表本网立场!


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